数百年来，冬虫夏草这味名贵中药被用于滋补保健、疾病防治和病后康复。现代药理学和临床药理学研究验证了冬虫夏草及其替代产品的疗效[24-32]。文献报道了从冬虫夏草中分离鉴定出了涉及十多个属的多种真菌[5,9,33-34]。真菌分子生物学研究报道了从冬虫夏草中检出中华被毛孢、中国弯颈霉、玫红假裸囊菌、蝙蝠蛾拟青霉、Geomyces pannorum 和产黄青霉等多种真菌 rDNA 序列[3,5-8,12-21,33-36]。虽然 Stensrud 等[22]聚类了三组与中华被毛孢相关的冬虫夏草菌序列，但郝剑谨等[21]应用 PCR 扩增 ITS 片段直接测序技术，未能从 21 个居群的冬虫夏草中测出 AT 偏倚基因型序列，认为“有较大变异的 rDNA-ITS 序列大多是从天然冬虫夏草分离培养后测序获得的”，质疑 AT 偏倚型菌在冬虫夏草中的天然存在。而杨金玲等[19]和 Xiao等[20]应用 PCR 扩增+分子克隆+测序方法，从天然冬虫夏草中同时测出 GC 和 AT 偏倚型序列。但在检测单株冬虫夏草样本时发现 AT 偏倚基因型的检出率低。我们在研究中证实了 PCR 技术本身的局限性，即应用天然冬虫夏草基因组 DNA，经 PCR 扩增后直接测序，不易检出 AT 偏倚基因型；而加用分子克隆技术，AT 偏倚基因型的检出率仍然很低。而改用 MassARRAY SNP 质谱突变基因分型法，我们在未成熟的冬虫夏草子座的 8 个 SNP 位点上均同时检出冬虫夏草菌 GC 偏倚型和转换突变 AT 偏倚型 rDNA 序列，以及至少两个未知序列的颠换突变基因型。本研究同步检测未成熟和成熟冬虫夏草子座 DNA 样品，发现 8 个SNP 位点的转换突变和颠换突变等位基因的检出率和质谱峰高随着冬虫夏草的成熟而变化，从而证实了Xiao 等[20]的发现，即各个突变基因型冬虫夏草菌在冬虫夏草成熟过程中并非恒量表达。本研究结果提示在研究冬虫夏草这个多种真菌和蝙蝠蛾幼虫尸体的复合体时，选择不同成熟期的冬虫夏草样品可获得不同的结果，当研究某菌的分子序列时获得阴性结果，研究者需要注意分子生物学技术本身的局限性。

目前文献资料和 GenBank 基因文库中还找不到冬虫夏草菌颠换突变基因型的资料。因此本研究的第一步 PCR 的引物设计无法做到对所有基因型都具有相同的相似性。试验中，我们依据 AB067721 序列设计了第一步 PCR 的引物和 5 个延伸引物。尽管这样的试验设计偏向于 GC 偏倚基因型序列的单碱基延伸反应，图 2A 仍然显示在未成熟冬虫夏草子座中，AT 偏倚型等位基因的分子浓度高于 GC 偏倚型等位基因。图2-4 和表 1 显示随着冬虫夏草的成熟，AT 偏倚型等位基因的分子浓度趋于下降；GC 偏倚型等位基因的分子浓度在不同的位点也有一定程度的降低，但占全部等位基因的比率升高。为了进一步检验两个 AT 偏倚基因型，我们又根据 AT 偏倚基因型序列设计第一步 PCR 引物 HsATp1/2，并根据 AB067740 序列设计了 3个延伸引物。图 5-6 和表 1 显示，随着冬虫夏草的成熟，AB067744 基因型（B 组[22]）等位基因的分子浓度下降或消失，而 AB067740 型（C 组[22]）等位基因的分子浓度上升。同时未知序列颠换突变基因型等位基因的分子浓度在不同的 SNP 位点出现不同程度的升、降变化。这些突变基因型菌的表达变化是代表具有共同祖先的不同菌物各自的增殖变化，还是代表在冬虫夏草成熟过程中同一物种内的基因型之间的相互转变，有待进一步研究。